Государственное санитарно-эпидемиологическое
нормирование Российской Федерации

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение химических соединений
в биологических средах

Сборник методических указаний
МУК 4.1.763 - 4.1.779-99

Минздрав России
Москва 2000

1. Разработаны под редакцией академика РАЕН, д.м.н., проф. Зайцевой Н.В., к.б.н. Улановой Т.С., к.б.н. Нурисламовой Т.В., Карнажицкой Т.Д., Суетиной Г.Н., Поповой Н.В., Митрофановой В.М., Плаховой Л.В., Рудаковой Е.А. (ПНИКИ детской экопатологии).

2. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 6 июля 1999 г.

СОДЕРЖАНИЕ

Сущность метода. 3

Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы.. 3

Требования к безопасности. 4

Требования к квалификации оператора. 4

Условия измерений. 4

Подготовка к выполнению измерений. 5

Выполнение измерений. 6

Вычисление результатов измерений. 6

Внутренний оперативный контроль. 7

Приложение А.. 8

Приложение Б. 8

Приложение В.. 9

 

УТВЕРЖДАЮ

Главный государственный санитарный
врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко

6 июля 1999 г.

МУК 4.1.766-99

Дата введения: 6 сентября 1999 г.

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Газохроматографический метод количественного определения ароматических
аминосоединений (анилин, N-метиланилин, о-толуидин, N,N-диметиланилин,
N-этиланилин, N,N-диэтиланилин) в биосредах (моча)

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТа 8.563-96 «Методики выполнения измерений» и ГОСТа Р 1.5-92 «Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов». Методика анализа метрологически аттестована и обеспечивает определение ароматических аминосоединений в моче в диапазоне концентраций:

анилин

0,045 - 2,0 мкг/см3

N-метиланилин

0,060 - 3,2 мкг/см3

о-толуидин

0,040 - 4,2 мкг/см3

N,N-диметиланилин

0,050 - 5,2 мкг/см3

N-этиланилин

0,045 - 3,0 мкг/см3

N,N-диэтиланилин

0,150 - 5,2 мкг/см3

Особенностью токсического действия ароматических аминосоединений являются функциональные нарушения центральной нервной системы, печени. Ароматические аминосоединения вызывают дерматиты, экземы и развитие аллергии.

АНИЛИН

С6Н5NH2

Мол. масса - 93,12

Анилин - маслянистая прозрачная светло-желтая жидкость со специфическим запахом. Ткип - 184,4 °С, Тплавл - минус 5,89 °С. Анилин растворим в органических растворителях и труднорастворим в воде. Анилин относится ко 2 классу опасности.

N-МЕТИЛАНИЛИН

С6Н5NHСН3

Мол. масса - 107,50

N-метиланилин - маслянистая прозрачная жидкость желтого цвета со специфическим запахом. Ткип - 195,7 °С, Тплавл - минус 57,0 °С. N-метиланилин растворим в органических растворителях и труднорастворим в воде. N-метиланилин относится к 3 классу опасности.

О-ТОЛУОИДИН

С6Н4NH2СН3

Мол. масса - 107,15

О-толуоидин - маслообразная прозрачная жидкость от светло-желтого до красновато-коричневого. Ткип - 199,7 °С, Тплавл - минус 24,4 °С. О-толуоидин растворим в органических растворителях и труднорастворим в воде. О-толуоидин относится ко 2 классу опасности.

N,N-ДИМЕТИЛАНИЛИН

С6Н5N(СН3)2

Мол. масса - 121,18

N,N-диметиланилин - маслянистая прозрачная жидкость желтого цвета со специфическим запахом. Ткип - 194,0 °С, Тплавл - 2,45 °С. N,N-диметиланилин растворим в органических растворителях и малорастворим в воде. N,N-диметиланилин относится ко 2 классу опасности.

N-ЭТИЛАНИЛИН

С6Н52Н5

Мол. масса - 121,1

N-этиланилин - маслянистая прозрачная жидкость с желтым оттенком со специфическим запахом. Ткип - 204,7 °С. N-этиланилин растворим в органических растворителях и труднорастворим в воде. N-этиланилин относится к 4 классу опасности.

N,N-ДИЭТИЛАНИЛИН

С6Н5N(С2Н5)2

Мол. масса - 149,23

N,N-диэтиланилин - маслянистая прозрачная жидкость желтоватого цвета со специфическим запахом. Ткип - 216,27 °С, Тплавл - минус 38,8 °С. N,N-диэтиланилин растворим в органических растворителях и малорастворим в воде. N,N-диэтиланилин относится к 4 классу опасности.

ДИФЕНИЛ

С6Н5С6Н5

Мол. масса - 154,21

Дифенил - бесцветные кристаллы. Ткип - 255,9 °С, Тплавл - 71,0 °С. Дифенил не растворим в воде, растворим в органических растворителях.

ХЛОРОФОРМ

CHCl3

Мол. масса - 119,38

Хлороформ - бесцветная жидкость с характерным сладковатым запахом. Ткип - 61,15 °С, Тплавл - минус 63,5 °С. Хлороформ растворим в этаноле, эфире, бензоле, ацетоне и сероуглероде, малорастворим в воде. Хлороворм относится ко 2 классу опасности.

Методика обеспечивает выполнение изменрений с суммарной погрешностью результата измерений:

анилин

12,4 %

N-метиланилин

11,8 %

о-толуидин

15,0 %

N,N-диметиланилин

10,0 %

N-этиланилин

21,42 %

N,N-диэтиланилин

15,4 %

при доверительной вероятности 0,95.

Сущность метода

Методика основана на предварительном концентрировании анализируемых соединений из биологического материала экстракцией хлороформом и последующего газохроматографического анализа хлороформенного экстракта.

Измерение концентрации ароматических аминосоединений выполняют методом газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектированием.

Нижний предел измерения в объеме пробы:

анилин

0,045 мкг,

N-метиланилин

0,060 мкг,

о-толуидин

0,040 мкг,

N,N-диметиланилин

0,050 мкг,

N-этиланилин

0,045 мкг,

N,N-диэтиланилин

0,050 мкг.

Определению не мешают ацетон, ароматические углеводороды и алифатические спирты. Длительность анализа, включая экстракцию пробы, - 40 мин.

Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы

При выполнении применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы. Допускается применение других типов средств измерений, вспомогательного оборудования и химреактивов с аналогичными метрологическими характеристиками.

Средства измерений

Хроматограф газовый с пламенно-ионизационным детектором

 

Весы лабораторные ВЛР-200 аналитические

ГОСТ 24104-80Е

Секундомер «Агат»

ГОСТ 5072-79Е

Микрошприцы МШ-10

ТУ 5Е2.833.106

Шприцы медицинские стеклянные вместимостью 5 см3

ТУ 64-1-378-83

Посуда лабораторная стеклянная

ГОСТ 1770-84

Колбы мерные вместимостью 100, 1000 см3

ГОСТ 1770-74Е

Пипетки вместимостью 1, 5, 10 см3

ГОСТ 20292-74

Воронка делительная

ГОСТ 23932-79

Вспомогательные устройства

Хроматографическая колонка стальная длиной 3 м и внутренним диаметром 3 мм

 

Бидистилятор

ГОСТ 15150-69

Редуктор кислородный

ТУ 26-05-235-70

Ротационный испаритель типа ИР-1, ИР-1М или аналогичный

 

Центрифуга СМ-4, 3000 об/мин

 

Материалы

Гелий в баллоне

ТУ 51-940-80

Водород технический

ГОСТ 3022-80

Воздух в баллоне

ГОСТ 11882-73

Реактивы

3 % OV-1 на хроматоне N-супер фракции 0,16 - 0,20 мм - неподвижная фаза для заполнения хроматографической колонки

 

Анилин ч.д.а.

ГОСТ 5810-78

N-метиланилин технический

ТУ 6-02-571-81

N,N-диметиланилин ч.д.а.

ГОСТ 5855-78

О-толуоидин ч.д.а.

ГОСТ 10205-73

N-этиланилин технический

ТУ 6214-12-37-77

N,N-диэтиланилин ч.д.а.

ГОСТ 10162-75

Дифенил ч.д.а.

 

Вода дистиллированная

ГОСТ 6709-72

Хлорид натрия х.ч.

ГОСТ 4233

Хлороформ фарм.

ГОСТ 20015-88

Требования к безопасности

Помещение для проведения измерений должно соответствовать требованиям «Пожарных норм проектирования зданий и сооружений» (СНиП IIА-5-700) и «Санитарных норм проектирования промышленных предприятий» (СН-245-71) и СНиП-74.

При выполнении работ должны быть соблюдены меры противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТа 12.1.004-85 и правила техники безопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.007-76.

При работе необходимо соблюдать «Правила по технике безопасности и производственной санитарии при работе в химических лабораториях», утверждены МЗ СССР 20.12.82 (М., 1981), и «Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением», утверждены Госгортехнадзором СССР 27.11.87 (М.: Недра, 1989).

При работе с реактивом соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТу 12.1.005-88.

При выполнении измерений с использованием газового хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика и опыт работы на газовом хроматографе.

Условия измерений

При проведении процессов приготовления растворов и подготовки проб к анализу соблюдают следующие условия:

- температура воздуха - (20 ± 5) °С;

- атмосферное давление 630 - 800 мм рт. ст.;

- влажность воздуха - не более 80 % при температуре 25 °С.

Выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией по прибору.

Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка хроматографической колонки, приготовление стандартных смесей, установление градуировочной характеристики.

Приготовление стандартных смесей

Для построения градуировочного графика собирают мочу, не содержащую исследуемых компонентов, и готовят серию рабочих стандартных растворов.

Стандартные растворы аминосоединений и внутреннего стандарта готовят в мерных колбах вместимостью 100 см3 с содержанием этих веществ 20, 30, 50, 60, 70 мг и дифенила с содержанием 100, 90, 70, 60, 50 мг в хлороформе.

Подготовка хроматографической колонки

Хроматографическую колонку перед заполнением неподвижной фазой промывают дистиллированной водой, ацетоном, гексаном, высушивают в токе инертного газа. Заполнение хроматографической колонки насадкой проводят под вакуумом. Концы колонки закрывают стекловатой и, не подключая к детектору, кондиционируют в токе газа-носителя (гелия) с расходом 55 см3/мин при температуре 300 °С в течение 18 ч. После охлаждения колонку подключают к детектору, записывают нулевую линию в рабочем режиме. При отсутствии мешающих влияний колонка готова к работе.

Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику устанавливают методом внутреннего стандарта (в качестве внутреннего стандарта - дифенил). Она выражает зависимость калибровочных коэффициентов (Ki/cm) от отношения площадей пиков на хроматограмме (Si/Sст) и строится по 5 сериям стандартных растворов для градуировки. Для этого в каждую колбу вместимостью 100 см3 вносят небольшое количество хлороформа и взвешивают, затем прибавляют аминосоединения и внутренний стандарт и взвешивают колбу повторно. Объем доводят до метки хлороформом и по разности результатов первого и второго взвешиваний вычисляют массу аминосоединений и внутреннего стандарта. Срок хранения - 3 ч.

Таблица

Стандартные растворы для установления градуировочной характеристики при определении концентрации аминосоединений (фрагмент шкалы)

Номер смеси для градуировки

1

2

3

4

5

Масса АНИЛИНА в 10 мм3 хлороформа, мкг

2,0

3,0

5,0

6,0

7,0

Масса N-МЕТИЛАНИЛИНА в 10 мм3 хлороформа, мкг

2,0

3,0

5,0

6,0

7,0

Масса О-ТОЛУИДИНА в 10 мм3 хлороформа, мкг

2,0

3,0

5,0

6,0

7,0

Масса N,N-ДИМЕТИЛАНИЛИНА в 10 мм3 хлороформа, мкг

2,0

3,0

5,0

6,0

7,0

Масса N-ЭТИЛАНИЛИНА в 10 мм3 хлороформа, мкг

2,0

3,0

5,0

6,0

7,0

Масса N,N-ДИЭТИЛАНИЛИНА в 10 мм3 хлороформа, мкг

2,0

3,0

5,0

6,0

7,0

Масса ДИФЕНИЛА в 10 мм3 хлороформа, мкг

10,0

9,0

7,0

6,0

5,0

В хроматографическую колонку через испаритель вводят по 10 мм3 каждого стандартного раствора и анализируют в условиях:

температура термостата колонок

110 °С,

температура испарителя

180 °С,

температура детектора

120 °С,

скорость программирования температуры

3 °С/мин,

расход газа-носитеяя (гелия)

55 см3/мин,

расход водорода

33 см3/мин,

расход воздуха

300 см3/мин,

шкала измерителя тока

10×10-12 А,

скорость диаграммной ленты

240 мм/ч,

время удерживания: хлороформа

1 мин 45 с,

анилина

6 мин 15 с,

N-метиланилина

9 мин,

о-толуидина

9 мин 15 с,

N,N-диметиланилина

9 мин 50 с,

N-этиланилина

11 мин,

N,N-диэтиланилина

20 мин,

дифенила

37 мин.

На хроматограмме находят значения площадей пиков и внутреннего стандарта и вычисляют калибровочные коэффициенты на основании анализа бинарных смесей: анилин-дифенил, N-метиланилин-дифенил, о-толуидин-дифенил, N,N-диметиланилин-дифенил, N-этиланилин-дифенил и N,N-диэтиланилин-дифенил. Значение калибровочного коэффициента вычисляют по формуле:

Si, Scm - площади пиков исследуемого компонента и стандарта, мм2;

Qi, Qcm - количество исследуемого компонента и стандарта, мг.

По результатам 5 измерений определяется среднее значение калибровочного коэффициента Ki/cm и строится градуировочный график в координатах калибровочный коэффициент - отношение площадей пиков Si/Scm.

Градуировку проверяют 1 раз в неделю и при смене партии реактивов.

Отбор проб

Отбор проб мочи в объеме 100 см3 производится в тщательно вымытый стеклянный сосуд с притертой пробкой. Анализ мочи проводить сразу или хранить в холодильнике не более 12 ч после отбора пробы.

Выполнение измерений

Анализируемую пробу мочи в количестве 100 см3 помещают в делительную воронку, добавляют 30 г (хлорид натрия) и 10 см3 хлороформа. Содержимое воронки интенсивно встряхивают 15 мин, после отстаивания хлороформенный экстракт сливают в пробирку и центрифугируют для денатурации белка 20 мин. Полученный центрифугат упаривают на ротационном испарителе и проводят газохроматографический анализ.

Вычисление результатов измерений

Расчет концентрации анилина, N-метиланилина, о-толуидина, N,N-диметиланилина, N-этиланилина, N,N-диэтиланилина (мкг/см3) в биопробе вычисляют по формуле:

С - концентрация анализируемых соединений в биопробе, мкг/см3;

Si, Scm - площади пиков компонентов и стандарта, мм2;

Ki/cm - калибровочный коэффициент;

mcm - навеска стандарта, мг;

V - объем пробы, см3.

Внутренний оперативный контроль

Внутренний оперативный контроль качества результатов контрольного химического анализа (сходимость, воспроизводимость, точность) осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве анализов и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению (МИ 2335-95).

Контроль сходимости выходных сигналов

Контролируемым параметром является относительный размах выходных сигналов хроматографа при вводах трех параллельных проб градуировочного раствора. Контроль осуществляется при проведении градуировки, при периодическом контроле градуировочных коэффициентов, а также при выполнении измерений.

Результат контроля признается положительным при выполнении условия:

S - площадь пика, мм2;

 - среднее арифметическое значение площади пиков при вводе 3 параллельных проб градуировочного раствора.

Оперативный контроль точности

Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.

Образцами для контроля являются представительные пробы биосред, к которым делаются добавки в виде раствора. Отбирают 2 пробы и к одной из них делают добавку в виде раствора таким образом, чтобы их содержание увеличилось по сравнению с исходным на 50 - 150 %. Каждую пробу анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результат анализа исходной рабочей пробы X и рабочей пробы с добавкой X'. Результаты анализа исходной рабочей пробы X и рабочей пробы с добавкой X' получают не по возможности, а в одинаковых условиях, т.е. их получает один аналитик с использованием одного набора мерной посуды, одной партии реактивов и т.д.

Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется условие:

|X' - X - С| < Кд, где

С - добавка к пробе в виде раствора с концентрацией, мкг/см3;

Кд - норматив оперативного контроля погрешности, мкг/см3.

При внешнем контроле (Р = 0,95) принимают

, где

 - характеристики погрешностей для исходной пробы и пробы с добавкой, мкг/см3.

При внутрилабораторном контроле (Р = 0,90) принимают, что

К'д = 0,84∙Кд

При превышении оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и их устраняют.

Приложение А

Рис. 1. Установка для создания равновесной паровой фазы.

1 - термометр; 2 - накидная гайка; 3 - шприц; 4 - резиновая мембрана; 5 - равновесный сосуд;
6 - проба; 7 - термостатируемая жидкостная баня.

Рис. 2. Стакан с навинчивающейся крышкой для фиксации пробки на флаконе.

Приложение Б

Прибор для анализа равновесной паровой фазы:

1 - термометр; 2 - накидная гайка; 3 - шприц; 4 - резиновая мембрана;
5 - равновесный сосуд; 6 - проба; 7 - термостатируемая жидкостная баня

Приложение В

Установка для перегонки с водяным паром